A. JUDUL
Analisa Asam Amino Hasil Hidrolisa Kasein Dengan Kromatografi Lapis Tipis
B. TUJUAN
Menganalisa asam amino hasil hidroloisis kasein yang diisolasi dari susu dengan cara kromatografi lapis tipis.
C. DASAR TEORI
Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponenkomponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Proses kromatografi juga digunakan dalam metode pemisahan komponen gula dari komponen non gula dan abu dalam tetes menjadi fraksi-fraksi terpisah yang diakibatkan oleh perbedaan adsorpsi, difusi dan eksklusi komponen gula dan non gula tersebut terhadap adsorbent dan eluent yang digunakan .
FASE DIAM
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet.Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.
FASE GERAK
Dalam kromatografi, eluent adalah fasa gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (jel silika).
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan itu ergantung pada:
1. Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
2. Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.
Anggaplah bercak awal pada alumina mengandung dua senyawa, yang satu dapat membentuk ikatan hidrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambil tiap-tiap bagian interaksi van der Waals yang lemah. Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penyerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan. Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa diserap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.
KROMATOGRAM
Kita akan mulai membahas hal yang sederhana untuk mencoba melihat bagaimana pewarna tertentu dalam kenyataannya merupakan sebuah campuran sederhana dari beberapa pewarna.
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.
Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.
Gambar menunjukkan lempengan setalah pelarut bergerak setengah dari lempengan.
Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.
Perhitungan nilai Rf
Jika anda ingin mengetahui bagaimana jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, anda dapat berhenti pada bahasan sebelumnya. Namun, sering kali pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing.
Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
Pengukuran berlangsung sebagai berikut:
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut
D. ALAT DAN BAHAN
1. Alat
| No. | Nama | Gambar | Jumlah |
| 1. | Seperangkat alat KLT |  | |
| 2. | Penggaris | | |
| 3. | Pensil | | |
| 4. | Hairdreyer | | |
2. Bahan
| No. | Nama | Jumlah |
| 1. | Lart. Sampel | Secukupnya |
| 2. | Lart. Valin | Secukupnya |
| 3. | Lart. Glisin | Secukupnya |
| 4. | Lart. Tyrosin | Secukupnya |
| 5. | Lart.n-butanol | 25 mL |
| 6. | Lart. asam asetat | 25 mL |
| 7. | Air | 6 mL |
| 8. | Ninhidrin | Secukupnya |
E. CARA KERJA DAN PENGAMATAN
| No. | Cara Kerja | Pengamatan | ||||||||||||||||||||
| 1. | Mempesiapkan alat dan bahan dan merangkainya seperti pada gambar disamping. Disini digunakan eluen dengan komposisi n-butanol:as.asetat:air = 25 : 6 : 25. Kemudian menotolkan sampel dan larutan asam amino yang lainnya. | | ||||||||||||||||||||
| 2. | menunggu sampai noda mulai naik. |  | ||||||||||||||||||||
| 3. | Mengukur jarak eluen dan jarak nodanya, untuk menghitung Rf-nya |
|
D. Analisa Data
Percobaan ini bertujuan untuk menganalisis asam amino dengan cara kromatrogafi lapis tipis (KLT). Digunakan KLT karena KLT memiliki beberapa kelebihan dibandingkan kromatografi kertas, diantaranya noda zat yang ditimbulkan sesudah kromatografi tidak banyak bila dibandingkan dengan noda semula. Zat yang diperlukan sedikit, waktu yang diperlukan tidak banyak. Pada KLT dipakai silica gel sebagai fase diamnya. Zat ini dipakai sebagai adsorben universal untuk kromatografi senyawa netral,asam maupun basa. Sebagai fase geraknya dipakai eluen yang berasal dari campuran n-butanol : asam asetat : air yaitu 25 : 6 : 25 yang bersifat polar.
Dalam percobaan ini dipakai 3 larutan standar asam amino yaitu glisin, valin dan tyrosin. Ketiga larutan ini ditotolkan pada plat KLT, kemudian sampel yang berisi campuran asam amino ditotolkan. Sebelum ditotolkan, plat KLT diberi tanda batas bawah dan batas atas 1 cm. Batas bawah digunakan untuk menotolkan sample. Tujuan diberi batas bawah ini adalah untuk mencegah agar sampel tidak sampai tercelup dan larut dalam eluen. Batas atas digunakan untuk mengakhiri proses elusi yang ditandai bahwa migrasi eluen sampai tanda batas. Proses migrasi eluen ini diharapkan agar sample juga ikut bermigrasi keatas.
Setelah sampel ditotolkan pada plat, plat dimasukkan dalam bejana yang telah diisi eluen, kemudian membiarkan elusi terjadi. Setelah eluen bermigrasi sampai batas atas, plat dikeluarkan dalam bejana dan dikeringkan. Plat yang telah kering kemudian disemprot dengan ninhidrin. Tujuan penyemprotan dengan ninhidrin adalah untuk menimbulkan warna noda-noda asam amino pada KLT (sebagai reagen yang dapat bereaksi dengan asam amino). Noda-noda itu timbul karena sampel yang ditotolkan bermigrasi dengan eluen. Setelah disemprot dengan ninhidrin, pada plat timbul warna noda:
G = Glisin à kuning
V = Valin à ungu
T = Tirosin à kuning
X = Sampel 1 à Kuning
Sampel 2 à Ungu
Setelah disemprot dengan ninhidrin, plat kemudian dikeringkan. Adapaun reaksi yang terjadi setelah disemprot dengan ninhidrin :
+ à + NH3 + CO2 + R-COH
|  | ||
+ NH3 à + 3 H2O + H+
Plat yang telah kering kemudian diukur jarak noda dari titik awal (batas bawah) serta jarak eluen. Hasilnya akan digunakan untuk menentukan harga Rf. Harga Rf ini digunakan untuk menganalisa kandungan asam amino yang ada dalam sampel. Karena masing-masing asam amino sampel mempunyai harga Rf yang berbeda.
Dari percobaan diperoleh harga Rf untuk :
Dari harga Rf sampel yang diperoleh, maka asam amino yang terkandung dalam sampel 1 adalah asam amino glisin, karena harga Rfnya paling mendekati dan warna noda yang timbul dalam sampel juga sama, yaitu kuning. Sedangkan asam amino yang terkandung dalam sampel 2 adalah asam amino Tirosin karena harga Rfnya paling mendekati.
Prinsip KLT adalah memisahkan campuran senyawa berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen senyawa diantara 2 fase gerak, yaitu fase diam dan fase gerak. Jenis eluen yang digunakan mudah menguap maka setelah plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi eluen, bejana segera ditutup. Adapun prinsip dasar KLT pada percobaan ini adalah perbedaan interaksi antara zat terlarut terhadap fase diam dan pelarutnya (fase gerak). Interaksi tersebut adalah interaksi antara asam amino dengan silica gel (polar) dan asam amino dengan eluen (polar).
Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reproduksibel.
Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf :
1. Ketebalan lapisan dan ukuran plat KLT
Ketebalan lapisan dan ukuran KLT dapat mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT. Makin tebal lapisan maka proses perambatan larutan pengembang makin lama dan dapat mengurangi kecepatan migrasi masing-masing komponen senyawa.
2. Kejenuhan eluen
Semakin jenuh eluen, semakin cepat migrasi, sehingga makin besar harga Rf.
3. Kepolaran eluen
Semakin polar eluen yang digunakan maka semakin cepat migrasinya sehingga semakin besar harga Rf.
4. Suhu dan kelembapan udara
E. Kesimpulan
1. Salah satu cara untuk menganalisis asam amino adalah dengan metode KLT(Kromatografi Lapis Tipis).
2. Keuntungan menggunakan KLT adalah waktu yang diperlukan untuk menghasilkan noda lebih singkat daripada kromatografi kertas, serta sample (Larutan Uji) yang dibutuhkan sedikit.
3. Noda yang muncul yaitu:
- Valin : ungu
- Glisin : kuning
- Tirosin : kuning
- Sample 1 : kuning
- Sample 2 : ungu
4. Nilai Rf dapat dicari dengan rumus :
5. Berdasarkan percobaan nilai Rf yang dihitung memperoleh hasil sbb:
- Valin : 0,3125
- Glisin : 0,125
- Tirosin : 0,21875
- Sample 1 : 0,15
- Sample 2 : 0,1875
6. Berdasarkan warna noda dan harga Rf yang dihasilkan, dapat disimpulkan:
- Sample 1 : mengandung glisin
- Sample 2 : mengandung tirosin
7. Eluen yang digunakan adalah campuran n-butanol : asam asetat : air = 25 : 6 : 25 dengan panjang eluen 8 cm.
F. Daftar Pustaka
Anna, Poedjiati. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press
Fessenden & Fessenden. 1986. Kimia Organik. Jakarta: Erlangga
Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press
Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Penerjemah: Thena. Jakarta: Erlangga
Sri, Mulyani dan Sri Retno D.A. 2011. Petunjuk Praktikum Biokimia (Jilid 3). Surakarta: UNS Press.
JAWABAN PERTANYAAN
1. Harga Rf tiap noda:
= 0, 3125 
= 0, 15 
= 0, 125 
= 0, 1875
= 0, 21872. Reaksi Ninhidrin dan asam amino
| | ||||
| |||||
+ → + NH3 + CO2 + R-COH
| |||
| |||
+ + NH3 à + 3 H2O + H+
3. Factor yang mempengaruhi harga Rf pada KLT:
· Ketebalan lapisan/ ukuran Plat KLT
· Kejenuhan Eluen
· Kepolaran Eluen
· Suhu dan kelembaban udara
· Kelarutan noda terhadap eluen
· Senyawa yang melekat pada fase diamnya
Tidak ada komentar:
Posting Komentar